Home ЛАБОРАТОРИЯ БИОХИМИИ ПРОТЕОЛИЗА


[Руководитель Лаборатории] [Состав Лаборатории] [Области интересов] [Основные достижения] [Уникальные/редкие методы исследования] [Межинститутские и международные связи] [Гранты, выполненные в Лаборатории] [Избранные публикации]



Лаборатория



Руководитель Лаборатории:

    ВАЛУЕВА Татьяна Александровна, профессор, доктор биологических наук, Лауреат Государственной премии Российской Федерации за 2002 год за работу «Химия макромономеров и полимерных гидрогелей, содержащих природные физиологически активные вещества»
    тел.: (495)-952-1384
    факс: (495)-954-2732
    e-mail: valueva ЭТ inbi.ras.ru

вверх

Состав лаборатории:
(
e-mail сотрудников даны в разделе "Телефоны и электронные адреса сотрудников Института")

    ГЕРАСИМОВА Н.Г., к.б.н.
    ГВОЗДЕВА Е.Л., к.б.н.
    ИЕВЛЕВА Е.В., к.б.н.
    КЛАДНИЦКАЯ Г.В., к.б.н.
    КУДРЯВЦЕВА Н.Н., к.б.н.
    РЕВИНА Т.А., к.б.н.

вверх

Области интересов:
         Изучение протеолитических ферментов фитопатогенных микроорганизмов и их природных ингибиторов из растений, механизмов регуляции процессов протеолиза у растений и физиологических функции протеиназ и их ингибиторов при патогенезе.
         Создание на основе протеиназ и их ингибиторов препаратов для биотехнологии и медицины.

вверх
Основные достижения:
           В 2010-2012 гг. были изучены ингибиторы сериновых протеиназ из нового сорта картофеля (Solanum tuberosumL. сорт Юбилей Жукова) столового назначения, в настоящее время районированного и возделываемого в Московской области. Для него характерно невысокое содержание крахмала (до 14%). Кроме того, растения картофеля этого сорта обладают повышенной устойчивостью к вирусным заболеваниям и поражению фитопатогенными микроорганизмами. В связи с этим определенный интерес представляет изучение белковых ингибиторов, присутствующих в клубнях данного сорта картофеля, и их роли, как в повышении его питательной ценности, так и в защитных процессах растения. Из клубней картофеля выделен и очищен до гомогенного состояния белок, обозначенный как PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor). Очистку белка проводили с помощью методов гель-хроматографии на сефадексе G-75 и ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B. Белок PKCI с одинаковой степенью эффективности подавлял активность химотрипсина и трипсина, образуя с ферментами эквимолярные комплексы. Значительно слабее он действовал на субтилизин Карлсберг. Показано, что белок содержит два независимых реактивных центра связывания трипсина и химотрипсина. Определена N-концевая 20-членная аминокислотная последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к семейству PKPI группы B (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Белок PKCI угнетал рост и развитие таких патогенных микроорганизмов как Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. и Phytophtora infestans (Mont.) de Bary, вызывающих у картофеля фузариозное увядание и фитофтороз соответственно. Он подавлял не только прорастание мицелия, но и ускорял разрушение зоооспор и макроконидий этих фитопатогенов. Это с большой степенью вероятности может свидетельствовать в пользу того, что белок играет определенную роль в защитной системе картофеля.
           Из двух-недельных проростков картофеля была выделена мРНК. Используя эту мРНК в качестве матрицы, методом обратимой транскрипции была получена кДНК. Ген-специфичные праймеры были сконструированы на основании последовательностей генов, кодирующих белки семейства PKPI группы B в шести сортах картофеля, которые представлены в банке генов NBCI Blast. Были синтезированы специфические прямой и обратный праймеры. Фрагменты кДНК были получены ПЦР с этими специфическими праймерами. После трасформации выделены клоны, несущие вставки, которые были секвенированы. Из них отобраны два клона, имеющие различные последовательности полноразмерных кДНК. Одна из них насчитывала 579 п.н. и кодировала белок, содержащий 193 аминокислотных остатка, другая – 555 п.н. и кодировала белок, содержащий только 185 остатков. При этом вторая аминокислотная последовательность оказалась сокращенной в С-концевой части молекулы. В этой связи первая кДНК была выбрана для анализа и последующей гетерологичной экспрессии. Анализ 3'-областей генов, кодирующих белки всех трех структурных групп белков PKPI, позволил предположить, что выделенная кДНК, обозначенная как PKPIJ-B, кодирует белок, относящийся к группе PKPI-B. Анализ этой последовательности позволил высказать предположение, что выделенная кДНК кодирует белок PKCI, присутствующий в клубнях. Оценка степени сходства последовательностей кДНК PKPIJ-B и генов, кодирующих белки PKPI-B в картофеле семи сортов, показала, что они содержат от 89 до 99% идентичных п.н. Оказалось, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул. Анализируя положения замен нуклеотидов в этих последовательностях, можно сделать заключение, что они локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.
           Проведена гетерологичная экспрессия в клетках Escherichia coli кДНК PKPIJ-B. Плазмида, обеспечивающая гетерологичную экспрессию белка, кодируемого этой кДНК, была создана на основе вектора pET23a. Ожидаемый продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPIJ-B, был обнаружен в основном в тельцах включения. Разработан метод его очистки, включающий FPLC-хроматографию на колонке с Mono Q, и последующий рефолдинг рекомбинантного белка. Результаты диск электрофореза показали, что рекомбинантный белок был гомогенен. Белок PKPIJ-B эффективно подавлял активность химотрипсина и трипсина, но не действовал на субтилизин Карлсберг и растительную цистеиновую протеиназу, папаин. Он также содержал два независимых реактивных центров связывания трипсина и химотрипсина. Таким образом, имеются все основания полагать, что выделенный рекомбинантный белок идентичен белку PKCI, выделенному из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Анализ этой последовательности позволил установить строение и локализацию реактивных центров в молекуле ингибитора.
           Показано, что изменение доступных источников питания в среде выращивания фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani Kuhn. приводит к изменению не только количества продуцируемых протеиназ, но и их природы и специфичности действия. Минеральный источник азота подавлял секрецию протеиназ у гриба, культивируемого на среде, содержащей термостабильные белки картофеля, а органический источник азота наряду с ускорением роста мицелия повышал их секрецию. На основании анализа субстратной специфичности внеклеточных протеиназ гриба установлено, что присутствие в культуральной среде термостабильных белков картофеля индуцировало секрецию преимущественно трипсиноподобных протеиназ, а добавление к ним белков дрожжевого экстракта – субтилизиноподобных, подавляя при этом продукцию трипсиноподобных ферментов. По-видимому, в среде, обогащенной органическим источником азота, мицелиальный гриб R. solani утрачивает патогенные свойства и становится сапрофитом.
           Совместно с лабораторией химии медико-биологических полимеров Института нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН создан и внедрен в практическую медицину гемосорбент «Овосорб», использующийся для удаления протеиназ из крови. Разрабатываются подходы подходы к созданию препаратов инсулина для перорального применения.
вверх

Уникальные/редкие методы исследования (на базе собственного оборудования), имеющиеся в лаборатории:
    В лаборатории разработаны методы синтеза аффинных сорбентов для выделения протеиназ и их ингибиторов из сложных белковых смесей. Синтезированные сорбенты были успешно использованы как для биотехнологических, так и медицинских целей.

вверх

Межинститутские и международные связи:
    Работы в рамках сотрудничества Россия-НАТО проводились совместно с коллегами из лаборатории проф. А. Сантино Института изучения продуктов питания Итальянского национального совета по науке и технике (CNR-ISPA, г. Лечче, Италия)
    Работы в рамках соглашения о научном сотрудничестве РАН с НАН Беларуси по теме «Выделение, очистка, физико-химические свойства и возможности практического использования белков-ингибиторов протеиназ наиболее перспективных видов растений семейства Compositae» проводятся с Институтом экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси.
вверх

Гранты, выполненные в Лаборатории:
    1. Грант РФФИ, № 96-04-48079, 1996-1997 гг.
    "Ингибиторы протеиназ - защитные белки растений",
    руководитель - проф. В.В.Мосолов.
    2. Грант РФФИ, № 98-04-48191, 1998-1999 гг.
    "Изучение структуры и механизма индукции растительного белка-ингибитора протеиназ",
    руководитель - проф. В.В.Мосолов.
    3. Грант РФФИ, № 01-04-48072, 2001-2002 гг.
    "Изучение ингибиторов сериновых протеиназ типа Кунитца в клубнях картофеля: молекулярное клонирование генов и их характеристика, механизм индукции при патогенезе",
    руководитель - проф. Т.А.Валуева.
    4. Грант РФФИ, № 04-04-45644, 2004-2006 гг.
    «Ингибиторы субтилизина из картофеля: взаимодействие с экзопротеиназами фитопатогенных грибов и их функции при патогенезе»,
    руководитель - проф. Т.А. Валуева.
    5. Грант в рамках сотрудничества Россия-НАТО, № JSTC.RCLJ.98102 , 2004-2005 гг. «Разработка универсальной системы детекции генов, кодирующих протеиназные ингибиторы типа Кунитца в различных сортах картофеля»
    6. Грант РФФИ, № 07-04-00254-а, 2007-2009 гг.
    «Ингибиторы трипсина типа Кунитца из клубней картофеля грибов и их функции при инфицировании растений фитопатогенными микроорганизмами»,
    руководитель - проф. Т.А. Валуева.
вверх

Избранные публикации:

    1. Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Герасимова Н.Г., Гвоздева Е.Л., Валуева Т.А. Белок-ингибитор трипсина из клубней картофеля. Биохимия. 2010. Т. 75. № 1. С. 46-51.
    2. Кудрявцева Н.Н., Гвоздева Е.Л., Софьин А.В., Валуева Т.А. Влияние среды культивирования гриба Rhizoctonia solani на секрецию протеолитических ферментов. Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 3. С. 355-362.
    3. Валуева Т.А., Валуев И.Л., Обыденнова И.В., Валуев Л.И. Химическая модификация белков «умными» полимерами. Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. № 6. С. 769-773.
    4. Иевлева Е.В., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г. Взаимодействие экзопротеиназ фитопатогенного гриба Fusarium culmorum с белками-ингибиторами растений. Картофелеводство. 2010. Т. 18. С. 110-120.
    5. Кудрявцева Н.Н., Гвоздева Е.Л., Софьин А.В., Валуева Т.А. Влияние азотного питания на специфичность патогенного гриба Rhizoctonia solani. // Картофелеводство. 2010. Т. 18. С. 141-150.
    6. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Раневая репарация клубней картофеля. Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 253-258.
    7. Ревина Т.А., Парфенов И.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля. Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-271.
    8. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в клубнях картофеля. Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 4. С. 402-407.
    9. Зиновьева С.В., Васюкова Н.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Участие салициловой кислоты в устойчивости растений к паразитическим нематодам. Известия РАН. Серия биологическая. 2011. № 5. С. 1-7.
    10. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеолитических ферментов при абиотических стрессах у растений. Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 5. С. 501-507.
    11. Valueva T.A., Kudryavtseva N.N., Revina T.A., Sof'in A.V., Gvozdeva E.L., Ievleva E.V. Comparative analyses of exoproteinases produced by three phytopathogenic microorganisms. J. Pathogens. 2011. V. 2011. doi:10.4061/2011/947218.
    12. Valueva T.A., Parfenov I.A., Pevina T.A., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor. Plant Physiol. Biochem. 2012. V. 52. № 1. P. 83-90.

вверх


[Главная страница] - [Карта сайта] - [Поиск по сайту] - [Написать в ИНБИ ]


email to INBI
Last review: 14 December, 2012.
© A.N.Bach Institute of Biochemistry of RAS, 2001-2012